Hektoen Agar leicht erklärt

Selektives Nährmedium zur Differenzierung von Salmonella und Shigella im Labor

Der Hektoen Agar wird in der Stuhldiagnostik ähnlich wie der XLD-Agar vor allem zur Differenzierung von Salmonellen und Shigellen gegenüber anderen Enterobakterien eingesetzt. Aufgrund dieser wichtigen Funktion gehört er, meist in Kombination mit weiteren Nährmedien, zur Standardausstattung vieler mikrobiologischer Labore.

Wer sich vorab einen Überblick über die verschiedenen Nährmedien verschaffen möchte, findet in meinem Artikel „Mikrobiologie leicht erklärt: Nährmedien, ihre Typen und Anwendungen“ eine kompakte Einführung.

Hektoen-Agar

Die Zusammensetzung von Hektoen Agar unterscheidet sich geringfügig zwischen den Herstellern.

Zusammensetzung

Peptone
Hefeextrakt
Laktose
Saccharose
Salicin
Gallensalze
Natriumchlorid
Natriumthiosulfat
Ammoniumeisen(III)-citrat
Fuchsin
Bromthymolblau
Agar

Der Hektoen Agar gehört gleichzeitig zu den Selektiv- und Differentialmedien. Was das bedeutet, schauen wir uns gleich genauer an.

Hektoen Agar als Selektivmedium

In der Stuhldiagnostik liegt der Fokus vor allem auf dem Nachweis gramnegativer Stäbchenbakterien. Um diese gezielt zu untersuchen, soll das Wachstum grampositiver Erreger unterdrückt werden. Im Hektoen Agar übernimmt diese selektive Wirkung das Gallensalz. Gallensalze wirken im Nährmedium membranschädigend, indem sie Lipide der bakteriellen Zellmembran angreifen und dadurch besonders das Wachstum empfindlicher grampositiver Bakterien hemmen, während viele gramnegative Darmbakterien durch ihre äußere Membran besser geschützt sind. In der Literatur finden sich auch Hinweise, dass Fuchsin und Bromthymolblau eine unterstützende Wirkung auf die Hemmung von grampositiven Bakterien hat.

Hektoen Agar als Differentialmedium

Beim Hektoen Agar wird es im Vergleich zu manch anderen Nährmedien etwas komplexer. Seine besondere Stärke liegt in der Kombination mehrerer Komponenten, die gezielt an den Differenzierungsprozessen beteiligt sind. Dazu zählen Laktose, Saccharose und Salicin sowie die Indikatorsubstanzen Fuchsin, Bromthymolblau, Natriumthiosulfat und Ammoniumeisen(III)-citrat. Durch das Zusammenspiel dieser Bestandteile lassen sich verschiedene bakterielle Stoffwechseleigenschaften sichtbar machen und somit unterschiedliche Erreger voneinander unterscheiden

Laktose, Saccharose und Salicin

Zunächst richtet sich der Blick auf die im Hektoen Agar enthaltenen Kohlenhydrate Laktose, Saccharose und Salicin (Zuckeralkohol), die eine zentrale Rolle bei der Differenzierung der Enterobakterien spielen. Die meisten nichtpathogenen bzw potentiell pathogenen coliformen Darmbakterien sind in der Lage, mindestens einen dieser Zucker zu fermentieren. Dabei entstehen organische Säuren, welche den pH Wert des Mediums absenken. Der enthaltene Indikator Bromthymolblau reagiert auf diese Ansäuerung mit einem Farbumschlag von grün nach orangegelb, sodass zuckerverwertende Bakterien gelbe bis orangefarbene Kolonien bilden. Ein laktose- und saccharosenegativer Erreger, der Salicin verwertet, erscheint in rosa bis orange-gelben Kolonien.

Salmonellen und Shigellen sind hingegen nicht in der Lage, Laktose, Saccharose oder Salicin zu verwerten. Da keine relevante Säurebildung stattfindet, bleibt der pH Wert des Mediums weitgehend unverändert und die Kolonien erscheinen transparent, hellgrün oder blaugrün. Dieses typische Erscheinungsbild ermöglicht eine erste Abgrenzung gegenüber den meist orangegelben Kolonien der oliformen Darmflora.

pH-Indikatoren Bromthymolblau und Fuchsin

Der Farbstoff Bromthymolblau ist unter anderem auch für die blau/ grüne Farbe der Agars verantwortlich. Einige Bakterien, vor allem gramnegative Stäbchen aus der Familie Enterobacteriaceae, können dank des Enzyms β-Galactosidase Lactose abbauen. Beim Lactoseabbau entsteht Säure, was den pH-Wert im Medium senkt. Genau hier kommt Bromthymolblau ins Spiel, es dient als pH-Indikator. Sinkt der pH-Wert unter etwa 6, färbt sich das Medium gelblich. Kolonien lactosepositiver Bakterien erscheinen dadurch oft in gelben Kolonien. Fuchsin verstärkt die Farbverschiebung bei der Fermentation von Laktose, Saccharose und Salicin und trägt damit zur typischen gelb bis orange/rot/rosa Darstellung säurebildender Kolonien bei.

Natriumthiosulfat/Ammoniumeisen(III)-citrat

Bakterien wie Salmonella spp., Citrobacter spp. oder Proteus spp. sind in der Lage, Natriumthiosulfat zu Schwefelwasserstoff (H2S) zu reduzieren. Der freigesetzte Schwefelwasserstoff reagiert anschließend mit dem im Medium enthaltenen Ammoniumeisen(III)-citrat zu Eisensulfid (FeS), was zu einer schwarzen Verfärbung der Bakterienkolonien führt. Demnach können neben Salmonella spp. auch Proteus spp. und Citrobacter spp. schwarze Kolonien auf Hektoen Agar ausbilden. Der entscheidende Unterschied liegt jedoch in der Färbung des umgebenden Agars sowie im Kolonierand.

Während Salmonella spp. typischerweise transparent, hellgrün oder blaugrün mit schwarzem Zentrum erscheinen, zeigen Proteus spp. und Citrobacter spp. häufig eine gelbliche Verfärbung des Agars, insbesondere im Randbereich der Kolonien. Diese Kombination aus H2S-Bildung, Koloniefarbe und Umgebungsfärbung des Mediums ermöglicht eine zuverlässige Differenzierung der relevanten Erreger.

Enterobakterien

Proteus mirabilis, mit typisch schwarzem Zentrum aber gelben Kolonien

Citrobacter spp., mit typisch schwarzem Zentrum aber gelb/ orangenen Kolonien

Salmonella spp., nach 24h erste schwarze Verfärbungen zeigen sich, aber die Kolonien bleiben bläulich/ grün transparent

Salmonella spp., nach 48h mit typisch schwarzem Zentrum

Fazit

Der Hektoen Enteric Agar ist ein klassisches Beispiel für ein Medium, das Selektivität und Differenzierung miteinander kombiniert. Durch die enthaltenen Gallensalze wird das Wachstum vieler grampositiver Bakterien deutlich gehemmt, sodass vor allem gramnegative Darmkeime zur Darstellung kommen. Gleichzeitig ermöglichen die Kohlenhydrate Laktose, Saccharose und Salicin eine gezielte Unterscheidung innerhalb dieser Gruppe. Bakterien, die diese Zucker fermentieren, bilden Säuren, wodurch der pH Wert sinkt und sich die Kolonien durch die Indikatoren Bromthymolblau und Säurefuchsin gelb bis orange verfärben.

Nicht fermentierende Erreger wie Salmonellen oder Shigellen bleiben dagegen grünlich bis blaugrün und lassen
sich so bereits im ersten Überblick von der typischen coliformen Begleitflora abgrenzen. Insgesamt zeigt der Hektoen Agar damit sehr anschaulich, wie gezielte Stoffwechselunterschiede genutzt werden können, um klinisch relevante Erreger aus einer komplexen Mischflora herauszufiltern und erste diagnostische Hinweise zu gewinnen.

Mehr über den Umgang mit gramnegativen Erregern und deren zunehmende Resistenz findest du in meinem Artikel „Antibiotikaresistenzen„.

Und wenn du noch mehr Lust auf Mikrobiologie bekommen hast, dann schau dir doch mal mein tolles Quizbuch an.